Efecto protector en planta de garbanzo de aislados bacterianos y fúngicos

La producción de garbanzo en México es mayor que la de la producción total de Europa

Fundación Produce Sinaloa, A.C., apoya actualmente el proyecto Selección in vitro de microorganismos antagonistas a la raza 5 de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (FOC) agente causal de marchitez en el garbanzo cultivado en Sinaloa, cuyos objetivos para el presente ejercicio son:
1. Describir proceso de reproducción de cepas bacterianas y fúngicas contra FOC raza 5, preservadas en tubos con medio TSA y crioviales, respectivamente.
2. Estructurar informe técnico de los procesos de aislados de pseudomonas y de Bacillus caracterizados en plantas de garbanzo por su efecto protector contra la raza 5 de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.
3. Estructurar documento técnico de los procesos de aislados fúngicos de antagonistas caracterizados en plantas de garbanzo por su efecto protector contra la raza 5 de FOC.
4. Determinar proceso de reproducción y solicitar patente de registro de cepas bacterianas con actividad antagonista contra FOC raza 5, preservadas en tubo con medio TSA y cepas fúngicas con actividad antagonista contra FOC raza 5, preservadas en crioviales.

AVANCES DEL PROYECTO
Materiales
SEMILLAS DE GARBANZO
Variedad Blanco Sinaloa-92 (Blanco Sinaloa-92). Para características agronómicas ver Cuadro 1.

AISLADOS BACTERIANOS
Los aislados bacterianos de Bacillus: Bacillus subtilis (T442), Bacillus coagulans (T3141) y de Pseudomonas: Pseudomonas sp (7AI), Agrobacterium radiobacter (T751).

AISLADOS FÚNGICOS
Los aislados fúngicos: Trichoderma (HRG-050), Trichoderma (HRG-060) y FOC raza 5.

Métodos
ACTIVACIÓN DE AISLADOS BACTERIANOS DE BACILLUS Y PSEUDOMONAS
Microorganismos bacterianos de la colección del Centro de Ciencias de Sinaloa (CCS), almacenados en refrigeración en el Laboratorio de Biotecnología para un Desarrollo Agrícola Sustentable (BIDAS) y que mostraron previa actividad antagonista en plantas en invernadero contra FOC raza 5, fueron crecidos por medio de asada en placas de Petri conteniendo los medios AN para Bacillus y Agar FLO.
Las cepas utilizadas fueron Bacillus subtilis (T442), Bacillus coagulans (T3141), Pseudomonas sp (7AI), Agrobacterium radiobacter (T751).
El procedimiento inició de cultivos almacenados en tubos con medio TSA inclinado, de los cuales se hicieron asadas en las placas con los medios antes indicados y se observó que hubiese crecimiento a las 24 horas.

ACTIVACIÓN DE LOS AISLADOS FÚNGICOS ANTAGONISTAS
Activación de los aislados de hongos rizosféricos de plantas de garbanzo que mostraron previa actividad antagonista in vitro (en condiciones de laboratorio) contra FOC raza 5, de la colección del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD), almacenados en refrigeración. Para ello, por el método de diluciones en placa, las cepas HRG050 (Trichoderma sp), HRG060 (Trichoderma sp), se crecieron en cajas de Petri conteniendo el medio PDA (agar, papa, dextrosa).

ACTIVACIÓN DE FUSARIUM OXYSPORUM F. SP CICERIS (FOC) RAZA 5
El hongo fitopatógeno FOC raza 5 proveniente de cultivo almacenado en refrigerador de la colección del CCS, dicho hongo fue activado en placas con medio PDA y posteriormente incubadas a 25 °C (grados centígrados) durante cinco días.

PRESERVACIÓN DE CEPAS
Las cepas bacterianas y fúngicas antagonistas, así como el hongo fitopatógeno (FOC), fueron inoculados a tubos con agar inclinado con los medios respectivos Agar FLO para Pseudomonas, AN para Bacillus y PDA para los hongos y se almacenaron en refrigeración a 4 °C para su posterior utilización

PRODUCCIÓN DE INÓCULO BACTERIANO
La producción de inóculo bacteriano se realizó de la siguiente manera para cada una de las cepas con previa actividad antagonista in vitro, dichas cepas fueron Bacillus subtilis (T442), Bacillus coagulans (T3141) y de Pseudomonas: Pseudomonas sp (7AI), Agrobacterium radiobacter (T751) .
El procedimiento se llevó a cabo en la campana de flujo laminar bajo condiciones asépticas; una vez dentro los medios de cultivo, material biológico y equipo necesario, se procedió a inocular un matraz de 500 mL (mililitros), conteniendo 300 mL de caldo nutritivo (Peptona 5 gramos, extracto de carne 3 gramos, pH final 6.9 ± 0.2) para Bacillus y caldo soya triptocaseína (peptona de caseína 17 gramos, peptona de soya 3 gramos, NaCl 5 gramos, K2HPO4 2.5 gramos, dextrosa 2.5, pH final 7.3 ± 0.2) para Pseudomonas, con la cepa de interés mediante el empleo de una asa de platino, con ese instrumento se tomó una muestra de la cepa contenida en una caja de Petri; posteriormente se flameó con el mechero la boca de matraz y se cubrió con el tapón de algodón-gasa y aluminio, para evitar contaminación cruzada también se cubrió con papel parafilm.
Una vez inoculados todos los matraces con su respectiva cepa, se procedió a incubarlos en una incubadora a 28 °C con agitación 150 RPM (revoluciones por minuto) durante 36 horas con la finalidad de tener la suficiente biomasa.
Después, el contendido de cada uno de los matraces fue colocado en tubos para centrífuga, con la finalidad de cosechar la biomasa de cada una de las cepas; en el proceso se empleó una centrifuga Sigma 3–18P, bajo las siguientes condiciones 20 minutos a 2776 x g (3800 RPM) a temperatura ambiente. Finalmente, la biomasa cosechada se colocó en un frasco para centrifuga Falcon de 50 mL y se almacenó bajo refrigeración a 4 °C hasta su utilización.

PRODUCCIÓN DE INÓCULO DE HONGOS ANTAGONISTAS
La producción de inóculo de hongos con previa actividad antagonista in vitro, de las cepas HRG050 (Trichoderma sp), HRG060 (Trichoderma sp), se realizó en la campana de flujo laminar bajo condiciones estériles, una vez en el interior, las cajas de Petri con medio PDA, el material biológico y el equipo necesario, se procedió a inocular cuatro cajas de Petri para cada una de las cepas de interés, mediante el método de porción (plug), el cual consistió en hacer un corte en el medio de cultivo de aproximadamente de 1 cm2, donde se colocó la porción de la cepa de interés de hongo; enseguida, se procedió a tapar cada caja de Petri y sellarla con papel parafilm; una vez inoculadas todas las cajas, se procedió a incubarlas a 28 °C durante 24 horas en una posición boca arriba con la finalidad de que se adhiriera bien el inóculo. Después del mencionado tiempo, las cajas de Petri fueron dispuestas boca abajo para evitar condensación en las cajas y posible contaminación cruzada. La incubación continuó durante cinco días más, bajo las mismas condiciones. Después del periodo de incubación las cajas de Petri con el crecimiento de cada una de las cepas fueron cubiertas con papel aluminio y almacenadas bajo refrigeración a 4 °C hasta su utilización.

PRODUCCIÓN DE INÓCULO DE FUSARIUM OXYSPORUM F. SP. CICERIS RAZA 5 (FOC RAZA 5)
Para la producción de inóculo de FOC raza 5 se siguió el mismo procedimiento que para la producción de inóculo de hongos.

CUANTIFICACIÓN DE LOS INÓCULOS BACTERIANOS Y FÚNGICOS
Para determinar y/o cuantificar el número de bacterias que existen en una suspensión bacteriana a inocular tanto en las pruebas de patogenicidad y reacción de hipersensibilidad, se debe preparar la escala de McFarland´s, la cual consiste en mezclar soluciones de ácido sulfúrico y cloruro de bario al 1% (Cuadro 2).
La técnica consiste en comparar la turbidez de la suspensión bacteriana en estudio con la turbidez del tubo de la escala de McFarland´s, a la concentración que se requiera y para la cuantificación de hongos se utilizo el conteo de conidios/mL en cámara de Neubauer.

DISEÑO EXPERIMENTAL
Parcelas separadas al azar, el diseño experimental cuenta con ocho tratamientos, cada tratamiento con seis réplicas y cada réplica con cinco plantas. A continuación se indica cada uno de los tratamientos: T1= Testigo, T2= Fungicida, T3= Pseudomonas sp (7AI), T4= Bacillus subtilis (T442), T5= Agrobacterium radiobacter (T751), T6= Bacillus coagulans (T3141), T7= Trichoderma (HRG-050), T8= Trichoderma (HRG-060).

MONTAJE DEL EXPERIMENTO EN CAMPO
Preparación del terreno
Se llevó a cabo el rastreo, para proceder a hacer el surcado y aplicar el riego de presiembra.

Época de siembra
Para cualquier variedad es del 1 de noviembre al 15 de diciembre, exceptuando a Tumutama-88, la cual debe sembrarse durante noviembre, siendo el 26 de noviembre de 2013 el día de siembra del presente experimento en campo, y debido a que no hubo una buena emergencia de plantasz se llevó a cabo una resiembra el 16 de diciembre de 2013. En la resiembra se observó una buena emergencia de plantas en los diferentes tratamientos.

Método de siembra
Separación entre surcos de 80 centímetros a hilera sencilla. Surcos de 6 metros (cuatro surcos por tratamiento).

Densidad de siembra
La densidad de siembra es de 10 plantas por metro lineal de surco. (Densidad de siembra es igual a cuatro surcos por 6 metros por 10 plantas/metro)= 240 plantas por tratamiento.

Riegos
Se propone dar dos riegos de auxilio: el primero previo a la floración; es decir, a los cuarenta días, y el segundo al iniciar el llenado de cápsulas a los 70 días.

FERTILIZACIÓN
Se adicionarán de nitrógeno 120 kg/ha (kilogramos por hectárea) y de fósforo 40 kg/ha.

APLICACIÓN DE PLAGICIDAS
A continuación se presenta la formulación de funguicidad y plaguicidas empelados durante el montaje y seguimiento del experimento:
• Tierra de diatomeas (al alboreo en lomo de surco para control de larva de insecto).
• Nitrato de potasio 12-0-46= 8.10 kg/ha de planta a formación de fruto.
• Calanit solubles (nitricalcio 15.5%, nitrógeno total 19% calcio)
• Sulfato de magnesio.
• Aminoácidos 60 mL/10 L.
• Fierro quilatado (ULTRAKEL Fe).
• Herald. Fenpropatrin. Mosquita blanca (Dosis: 0.5L/ha; 6 mL/10 L/300 m2).
• Adherente Silcon M85 100 mL/200 L.
• Aceite metilado de soya 6 mL/10 L/300 m2.
• Insecticidad Rotamik.
• Abacmectina (Dosis: 500 mL/ha; 15mL10 L/300 m2).
• Ciperwest 20. Copremetrina. Control de gusano (500 mL/ha; 6 mL/300 m2).

El control biológico o biocontrol se basa en el empleo de microorganismos antagonistas (denominados agentes de control biológico, principalmente bacterias y hongos) contra patógenos que atacan a diferentes cultivos, también incluye el uso de variedades del patógeno menos virulentas o avirulentas, el empleo de variedades más resistentes del hospedero, la rotación de cultivos y la adición de abonos de origen animal y vegetal

Información proporcionada por el Dr. Rogelio Sosa Pérez, responsable del proyecto y perteneciente al Centro de Ciencias de Sinaloa. Este proyecto es apoyado por FPS, a través de su Consejo Consultivo zona centro.